细胞消化经验总结：你的细胞消化好了吗?

　　细胞培养，是一件需要不断积累的实验室必备技能，细胞消化是细胞培养中不是那么复杂的一个步骤，虽然这个步骤不难，但是还是有很多人会“栽”在这一步上，比如对一些增殖比较快的细胞来说，如果你没有掌握好细胞消化的时间，那么，这些细胞就很有可能会由于营养物质缺乏或者细胞接触性抑制而导致状态变差或死亡，这样你的实验就不可避免的延期了，所以，细胞消化也需要我们好好去探索一番。

　　细胞什么时候需要消化?

　　一般细胞长至80%-90%密度则需要传代消化，贴壁细胞传代前，需要把细胞用消化试剂从培养容器表面解离出来，细胞得以分离成单个悬液传代至含新鲜培养基的新容器内。

　　细胞消化的方法主要有四种：

　　一、酶消化法

　　这个方法是用得最多的，主要是用胰蛋白酶，一般浓度在0.25-0.5% ，消化的时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化，一般是从从几分钟到几十分钟不等。

　　一般来说，0.25% 的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下消化1-5 分钟就足够了。

　　需要注意的是，Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、 Mg2+ ，含EDTA的胰酶活性更高;

　　最后，可用含血清的培养基终止胰酶消化。胰酶对温度敏感，需在-20℃运输和保存，不能反复冻融。

　　二、离子螯合剂

　　离子螯合剂不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。

　　一般用得最多的是EDTA，一般浓度在0.02% 左右，作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。

　　注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶，因此配制时应调节好酸碱度，

　　这种方法相对来说操作简单，无需使用蛋白或血清终止。

　　三、物理法

　　也就是直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。

　　四、冷冻法

　　这种仅能用于细胞传代时，因为它无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，主要是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，也不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞，不足是细胞可能会常小片脱落。

　　细胞的状态怎么样才算消化好了?

　　①不是细胞分布很离散的单个圆形才算消化好了

　　一般显微镜观察贴壁细胞，只要能移动了，多半呈沙状移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了， 说明细胞之间，细胞与培养皿之间的附着已经消失了，细胞已经独立分布了(虽然没有呈现很广的离散分布)，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。

　　②不是所有细胞消化后都会变成圆形

　　有些细胞(比如U87，U251)消化好了也不会变成圆形，只是呈半沙状。

　　③有些细胞即使变圆，也有脱落的细胞，但还是没消化好

　　比如7860，要等到大部分细胞脱落培养皿底部才可以停止消化，否则很难吹打下来，这种情况一般发生于难以消化的细胞。

　　④对于一些特殊的细胞需要消化过一点

　　有些细胞吹成单个细胞反而对细胞的状态会好一点，一但成团，细胞状态立马变差，比如LNCAP细胞。

　　消化过度的主要特征有哪些?

　　会导致相当一部分细胞损伤和死亡，刚传代后的培养液表面漂浮细胞团，肉眼可见漂着小片白色膜状物。如果细胞团中都是死细胞，则不会贴壁。如果细胞团中仍存在有活力的细胞，就会贴壁造成局部细胞密度不均匀，该局部较快形成中央坏死细胞区。

　　细胞消化过度怎么处理?

　　马上用培养基中和，用吸管吹打细胞， 收集全部的细胞到以无菌的离心管中800RPM 3 分钟。弃上清，用全培重悬，换新的培养瓶继续培养!! 状态不好的细胞在培养的过程中会死亡脱落，在换液的时候可以清除掉!!

　　细胞消化不下来是什么情况?

　　(1)有些细胞贴壁比较牢，因此每次消化吹打之后总会剩下一些细胞，或者细胞长得较好而培养瓶太久没换，为了顾全大部分有活力的细胞，细胞消化要适可而止。

　　(2)不同种类的细胞所需消化时间也不同。因为贴壁细胞的消化一般在2分钟左右，对于个别出现的细胞难以消化，经过多次消化和反复吹打之后仍无效，就放弃吧。

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