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转染效率不高?那是因为你没有掌握这些技巧......

来源:Procell  浏览量:  发布时间:2019-11-04 14:51:54

  转染是将核酸导入真核细胞中的过程,是细胞生物学、基因表达和基因抑制实验中的关键步骤。在现代生命可持续研究中,大部分的工作是利用基因功能研究来探索生命过程,如何将目的基因导入细胞内是科学实验过程中不可缺少的实验技术,而细胞转染是完成这一过程的必需步骤。

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  在实验当中,我们经常遇到的一种情况就是转染完细胞,去跑qpcr验证,结果显示转染效率太低以至于无法进行后续的实验......

  那么,到底该如何选择转染方法?转染中要注意的事项有哪些?转染试剂该如何选择?今天就一起为大家介绍一下。

  转染方法的选择

  我们熟知且常用的转染方法主要有物理介导,化学介导,生物介导。

  但实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染(质粒转染)和生物介导中的慢病毒转染法。

  其中质粒转染操作简单,一般瞬时转染选择较多,但有些细胞系不容易转染,因此选择转染方式时一定要做足功课,亲身经历告诉我,千万不要图方便,否则转染效率简直崩溃。

  特别是养原代细胞的小伙伴,一点要认真选择!病毒转染一般具有能够稳定表达的优势,且其对原代细胞有较高的转染效率,其中更分为慢病毒转染,逆转录病毒转染和腺病毒转染,其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞,例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。

  转染技术的注意事项

  1、细胞状态

  众所周知,细胞的生长状态影响实验结果,原代细胞和传代次数多的细胞都不是最佳选择,处于对数生长期的细胞生长状态最好,最适合转染。同时,我们都知道细胞的密度不宜过大,大家往往注意的都是转染前的密度,失败过很多次的经历告诉大家,转染后的细胞密度更加重要。有时候转染时间太久,等到进行后续实验时细胞已经肆意生长,漂起来了,岂不前功尽弃,流着眼泪也要告诉大家,考虑好细胞的生长周期和转染的时间进行铺板,建议选择50%~80%区间密度进行细胞转染。

  2、实验污染

  跟细胞有关的实验当然要注意不能污染啦,细菌,真菌,支原体都是应该严格注意的,不仅会浪费试剂,也会影响实验结果。

  3、转染试剂的处理

  质粒转染:

  1,质粒的纯度会影响转染的效率,如果质粒不纯,其含有少量的盐,蛋白会严重影响转染复合体的形成,因为内毒素严重影响转染效率,还需进行质粒内毒素的处理。

  2,其次如选用lipo2000或lipo3000,需注意严格按照说明书的加样顺序添加,其中mix well只需用枪轻轻混匀或手指轻轻晃动,切忌用力吹打,会导致脂质体失去作用。

  稳转株的筛选

  根据不同的实验需求,如需进行划痕、transwell等培养时间较长的实验,最好使用稳转细胞株,而如果只需检测相应蛋白的表达不用较长时间培养,选择瞬转即可。

  质粒转染一般是瞬时转染,如需筛选稳定株需要在药物的作用下,因常用质粒载体pcDNA3.1,其含有neomycin的基因,可选择G418进行筛选,根据教程需要提前对不同浓度的G418进行细胞筛选,选择最适筛选浓度,可以通过阅读文献,选择一定的浓度区间大梯度进行筛选,在全部存活和死亡较多的两个浓度间再设定浓度梯度进行筛选,这样得出的筛选浓度更为准确。

  同时由于基因转染进入细胞内需要一定时间才能够表达出相应的蛋白质,但如果转染时间较长,细胞代谢时间较久,转染细胞也会逐渐减少,因此要合理控制进行筛选的时间。注意:药物筛选时细胞密度不要太低,否则密度太低全部筛死就可以快乐地进行下一次实验了。

  转染效率的验证

  1、最有效的验证方式必须是qPCR验证;

  2、荧光观察,使用病毒转染,明白自己病毒的情况,是荧光标记(一般是GFP)还是非荧光标记。质粒转染,可以在载体上添加荧光标记,帮助自己通过荧光观察转染效率。但是荧光并不能完全证明转染效率,还是通过核酸验证最为准确。

  推荐——Procell Nanofecter转染试剂

  如果你严格按照实验步骤来操作,最后转染效率还是不高的话,推荐你选择一款好的转染试剂,普诺赛的Nanofecter转染试剂是具有较高阳离子电荷密度的纳米材料分子,能高效地包裹大分子DNA、小分子寡核苷酸、siRNA形成小的带正电荷的纳米复合物微粒,这些微粒可以高效的结合到带负电荷的细胞表面残基,并通过细胞内吞作用进入细胞。Nanofecter含有的氨基在细胞内发生质子化,使囊泡释放复合物微粒进入细胞质,复合物解体后,DNA等核酸分子就能进一步进入到细胞核中,参与核内转录和表达。

  并且,此产品通过多种细胞测试和长期的实验验证,与传统的脂质体转染相比具有明显的优势:

  1,适用性广,适用于大多数细胞,可用于DNA和RNA转染;

  2,转染效率高,稳定性强,重复性好,数据可靠;

  3,毒性低,对细胞状态影响小,实验结果更真实;

  4,用量少,价格低,经济实惠。

  案例展示:

  1,使用Nanofecter转染试剂,质粒DNA转染24h,如下:

11.png

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  2,使用Nanofecter转染试剂,miRNA转染6h,如下:

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  3,质粒DNA转染与Lipo2000效果对比,如下:

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  温馨提醒:

  其实细胞转染并不困难,只要你规范操作,并且使用优质的转染试剂,那么操作起来就得心应手,如果您想了解或者选购上面的Nanofecter转染试剂的话,请点击我要选购

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