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细胞传代的时间老是掌握不好?这些经验要知道!

来源:Procell  浏览量:  发布时间:2019-12-31 15:43:27

  养细胞的小伙伴们都知道,细胞一定要传代,因为细胞在培养过程中不断的繁殖,数量也随之增加,然而培养皿/培养瓶的空间有限,增殖受到抑制,所以必须将一部分细胞移至别的培养皿/培养瓶,让细胞有足够生长空间。

  细胞传代也不仅仅是为细胞安一个更大的“家”,更重要的,是使细胞系或细胞株进一步增殖,这样,我们才能有足够的细胞做各种各样的实验。

  但是,对于传代的时间,很多小伙伴都掌握不好,因为对于不同的细胞来说,判断能否开始传代的标准略有不同,今天,我们就主要来聊一下,细胞传代的时间问题。

  什么时候进行细胞传代?

  对于贴壁培养和悬浮培养而言,判断是否需要传代主要看以下2个方面:

  • 细胞密度:

  贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代,正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复,转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖,但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地,

  悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时,悬浮培养的细胞会聚集成团块,转动培养瓶时培养基会变得浑浊。

  • 培养基耗竭:

  生长培养基 pH 值降低通常表示乳酸蓄积,乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性,而且 pH 值降低也是细胞生长的不利因素。pH 值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度,细胞浓度越高,培养基耗竭的速度越快。

  如果发现 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大,则应对细胞进行传代。

  细胞传代时间安排

  注意,一定要严格按照预定时间进行细胞传代,这样才能确保细胞的生物学行为稳定,便于监测其健康状态。

  要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度,直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量,细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如:变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如:未达到最佳温度,培养基过于陈旧)。

  强烈建议大家保留详细的细胞培养记录,记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。

  最好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作 (如更换培养基种类),如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合,则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时,不进行传代。

  贴壁细胞传代流程:

  以下实验方案介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程,为自己所用的细胞系传代时,建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明,偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常,甚至培养完全失败。

  (1)传代前准备

  用具紫外照射消毒(30min):无菌培养瓶,15ml离心管,移液管,移液枪,枪头。

  倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

  (2)胰蛋白酶/EDTA消化

  从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧),75%酒精进行瓶口消毒,吸掉培养细胞的旧培养基,PBS缓冲液洗去残留的旧培养基,按25m2/ml消化液比例加入消化液,消化液中EDTA浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察,待所有细胞变圆后立即拿入超净台内,加入6ml细胞完全培养基中止消化,消化时间为1-5min,具体以细胞而议,采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面,注意吹打全部培养表面,可以按照先左右吹打,后上下吹打的方式,取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内,每分钟1000rpm,RT5min。

  (3)制备细胞悬液及培养

  吸取上清液丢弃,不要吸到底部的细胞沉淀,向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基,吹打混匀,吹打过程中尽量不要产生气泡,以1:2的比例进行分瓶。

  (4)结果观察

  第二天观察细胞情况,细胞培养换液时间一般2-3天。

  (5)注意事项

  1 严格无菌

  2 适度消化:把握好消化液的最佳浓度

  3 吹打细胞动作要轻柔

  悬浮细胞传代流程

  悬浮细胞传代就比较容易了,可以直接将培养瓶中的液体吸掉,只留下少量,然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多,感觉到比较脏时,可以将悬液移到离心管内,1000-1500rpm离心3min,弃上清,加入约2ml培养液,吹打至均匀,滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中,然后置于二氧化碳培养箱中培养。
  看了以上的内容,你学会了吗?细胞传代是一个需要不断积累经验的技术活儿,除了对时间的把握之外,还有很多方面需要注意。那么,如果你实在传代不好,导致珍贵的细胞污染或者死亡了怎么办呢?也别着急,来找Procell!

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