全国免费热线:400-999-2100

您身边的细胞培养专家!

忘记密码

个人邮箱:
验证码: captcha

账号激活

个人邮箱:
×
当前位置:首页 >> 技术支持 >> 实验指南 >> 详细内容

技术支持Technical Support

联系我们CONTACT US

细胞学堂 | 细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2021-12-02 13:41:02

细胞冻存与细胞复苏,是细胞培养过程中的常见工作。


细胞冻存,是指将细胞贮存在超低温环境中,使细胞暂时“冬眠”的技术,在需要的时候再进行复苏。


细胞复苏,是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻,并使细胞重新恢复生长的技术。


本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。 


细胞冻存篇


冻存原则


细胞冻存原则为“慢冻”,即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。


如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻,细胞会受到冷冻损伤而死亡。在冻存液中添加的保护剂(如DMSO、甘油)和在冻存盒中添加的异丙醇,都起到程序性降温的作用。


DMSO使用注意事项


DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,延缓温度下降速度,减少细胞内冰晶的形成,从而起到保护细胞的作用。


需注意的是,DMSO溶于培养基时,将释放大量热量,所以细胞冻存液需提前配制,不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中,避免烫伤细胞。


另外,DMSO属于致癌物质,使用时应戴好手套,规范操作。


程序冻存液配方


程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。血清比例为10%~90%,DMSO比例为5%~10%。根据普诺赛实验室细胞培养经验,推荐冻存液配比:55%基础培养基+40%胎牛血清+5%DMSO,难养细胞可用90%胎牛血清+10%DMSO冻存。


细胞冻存密度


细胞冻存和复苏过程中,不可避免会损失部分细胞,所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率,推荐密度为100~300万细胞/mL。


冻存操作方法


方法一:使用程序冻存盒 



使用程序降温盒是最常用的冻存方法。市面上的降温盒有些需要添加异丙醇,有些则不需要。


降温盒须恢复室温后再使用。


根据普诺赛实验室细胞培养经验,使用程序冻存盒冻存效果良好,没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。


操作步骤

步骤1:配制程序冻存液,放在室温备用或放在4℃预冷

步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

步骤3:用配制好的冻存液重悬细胞,按照1~1.5mL/管分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

步骤4:冻存管放入冻存盒,冻存盒放入-80℃冰箱过夜(24h)

步骤5:冻存管从冻存盒取出,转移至液氮长期保存


使用冻存盒操作示意图

 ▲ 使用冻存盒操作示意图


方法二:使用无血清非程序冻存液 



无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液,无需自己配制,无需降温盒,大大提升了便捷性。


但是,并非所有细胞都适用于这种冻存液,使用前必须做冻存测试,没问题后再批量应用。


操作步骤

步骤1:从冰箱拿出无血清非程序冻存液,待用

步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

步骤3:弃上清,加入适量无血清非程序冻存液,重悬细胞

步骤4:按照1~1.5mL/管的量分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

步骤5:将冻存管直接移入-80℃冰箱中,24h后转移至液氮长期保存


使用无血清非程序冻存液操作示意图

▲ 使用无血清非程序冻存液操作示意图


方法三:手动梯度降温 



在没有冻存盒或者非程序冻存液时,可以选择手动梯度降温。但手动梯度降温不适用于所有细胞,且效果不稳定,同样需要先做冻存测试。


操作步骤

步骤1:配制程序冻存液,放在室温备用或放在4℃预冷

步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

步骤3:用配制好的冻存液重悬细胞,按照1~1.5mL/管分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

步骤4:冻存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的顺序放置


手动梯度降温操作示意图

▲ 手动梯度降温操作示意图


细胞复苏篇


细胞复苏讲究“快融”,越快融化,细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂,但每一步都必须稳扎稳打,才能最大限度地提高复苏存活率。


细胞复苏步骤


步骤1:水浴锅预热至37℃备用


步骤2:准备15mL离心管,并向其中加入适量培养基待用

小贴士:离心管中加入2~9mL的培养基,比较难养的细胞,可适量增加培养基。


步骤3:将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴锅

小贴士:如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远(步行超过1min),要把细胞先置于干冰上,再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里,可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中,是为了预防污染。


步骤4:用力摇晃冻存管,使其在1分钟内融化

小贴士:这一步越快融化越好,最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化,可能是冻存液量偏多,或者摇晃力度不够。


步骤5:用纸巾擦拭水渍,转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液,缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管


小贴士:当同时复苏多管细胞时,注意不要弄混。


步骤6:1200rpm离心3分钟

小贴士:离心是为了去除DMSO,对于DMSO敏感的细胞,必须离心;若复苏的细胞对DMSO不敏感,步骤6、步骤7可以省略,直接将培养基补足至10mL,接种至培养器皿中,第二天换液。


步骤7:弃上清,用新鲜培养基重悬细胞,接种至新的无菌培养器皿中

细胞复苏操作示意图

▲ 细胞复苏操作示意图


做完步骤7,细胞就复苏好了。复苏的细胞需要一段时间恢复状态,复苏后的细胞密度低于80%时,48小时内不要换液,待细胞形态、生长速度等恢复正常,再进行细胞传代等操作。(不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃,应耐心等待至少一周。)


当然,细胞复苏后状态很好的情况下,可以提前开始后续的细胞培养实验。


温馨提醒:


如果您想要了解或选购细胞冻存液或辅助试剂,请点击我要选购,有任何疑问也可以点击右方的在线咨询,专业技术人员将为您提供解答。

您好,有什么可以帮到您的?

现在咨询
朱莎莉

朱莎莉

【 湖北、河南 】

刘本佳

刘本佳

【 江苏、上海、安徽 】

章臣雄

章臣雄

【 广东、云南 】

閤春喜

閤春喜

【 四川、陕西、甘肃、西藏 】

刘轶铭

刘轶铭

【 重庆 】

石文平

石文平

【 北京、黑龙江、吉林、辽宁 】

任施博

任施博

【 江西、福建、新疆、海南 】

李荣枫

李荣枫

【 天津、河北 】

2. 纪丽

纪丽

【 内蒙古、山西 】

陈雨兰

陈雨兰

【 湖南、山东、宁夏、青海 】

尹国文

尹国文

【浙江、广西、贵州】

黄龄

黄玲

【 四川、陕西、甘肃、重庆、西藏、浙江 】

李欢欢

李欢欢

【 江苏、安徽、河北、山西、天津、内蒙古 】

04普诺赛技术支持

04普诺赛技术支持

【 广东 、广西、贵州、云南】

卢丽丽

卢丽丽

【 北京、辽宁、吉林、黑龙江 】

林梦君

林梦君

【 上海、宁夏、青海、山东、福建】

徐婷

徐婷

【 湖北、湖南、河南、江西、新疆、海南】