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细胞学堂 | 培养NK-92/NK-92MI细胞时要注意什么?

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2022-01-19 10:32:38


NK-92细胞,是从外周血单核细胞衍生来的、IL-2依赖型NK细胞株。

NK-92MI细胞,源自NK92细胞系的IL-2非依赖的NK细胞株。

亲本细胞NK-92通过微粒体基因转化法,用逆转录病毒MFG-hIL-2载体携带的人IL-2cDNA进行转化。


作为同源细胞,NK-92与NK-92MI细胞存在诸多共性,但二者在培养方式及注意事项上也不尽相同。


下面,普诺赛将为同学们详细阐释,NK-92MINK-92细胞的收货以及培养注意事项。


01

细胞收货注意事项


除NK-92 细胞在分瓶后需添加IL-2之外,NK92MI与NK92细胞系在收货处理上,方法大致相同。具体操作如下:

细胞刚收到后,将细胞培养瓶先竖立静置2~4个小时,让细胞沉降到底部;

大细胞静置完后,将瓶中上面部分培养基小心吸出,留底部细胞和3ml左右培养基在原瓶;

吸出的细胞培养基离心收集细胞沉淀,离心转速1000转3分钟,或根据您的离心机实际情况而定,转速不宜过高;

将得到的细胞沉淀,用2~3ml NK-92/NK-92MI完培重悬后,放回原瓶继续培养过夜,一个T25最终培养体积是5~6毫升;

NK92细胞系可按照200 U/ml的浓度补加一点IL-2,因为原瓶留的培养基IL-2可能已部分失效,NK92MI细胞则不需要额外补加IL-2。

普诺赛出厂的培养瓶为不透气瓶盖,一定要拧松到不掉的程度,使细胞充分透气;

培养瓶横放,瓶口拧松透气,培养过夜;

第二天,视细胞密度和培养基消耗情况,进行分瓶。不建议直接进行离心操作,因为经过运输颠簸和各种处理,细胞很可能达不到最佳状态。尽量不要吹散细胞团,加完液轻晃培养瓶即可。


02

细胞培养注意事项

NK-92MI与NK-92细胞同源,在培养方法上也有很多共同之处。但由于两者对IL-2敏感程度不一,培养操作时略有差别。具体步骤如下:

NK92MI与NK92细胞系都为悬浮生长,大部分细胞聚集成团,少数细胞分散,并且细胞间隙会有较多的死细胞和细胞碎片;

NK-92细胞对IL-2敏感。培养基中IL-2降解,将导致细胞状态变差。IL-2在-20℃解冻后置于4℃冰箱保存,4℃保存不应超过两周。配制好的新鲜培养基要尽快用完,建议每次使用前拿出来常温预热,不要放培养箱预热,使用完毕后放回4℃冰箱保存;

实验室常备IL-2,发现细胞状态不好、散在细胞变多、细胞不生长等情况,以200 U/ml的浓度添加IL-2,培养2-3天后即可恢复状态;

NK-92MI细胞虽然对IL-2不敏感,正常培养不需要补加IL-2,但如果发现细胞状态不太好,散在细胞变多,细胞不生长等情况,也可以以200U/ml的浓度补加IL-2,培养2-3天后状态会有改善。

NK-92与NK-92MI细胞都对离心敏感。正常培养时,换液周期为2~3天,建议交替使用半量换液和离心换液法,即半量换液2~3次后,离心全量换液一次。尽量减少离心次数,细胞状态不佳或细胞量少的时候,一般不建议离心;

换液方法:

▶ 补液法:每2~3天补加适量(根据培养容器和原来细胞悬液体积来定,T25瓶一次补液1~2毫升即可)新鲜培养基(NK-92需要同时补加200 U/ml IL-2,而NK-92MI则不需要),补加2-3次之后,离心全部换液。


▶ 半换液法:以T25瓶子(瓶中装有5ml培养基)为例,竖起瓶子静置一段时间(竖瓶前轻拍培瓶,让轻贴底部的细胞团浮起来),待细胞沉底(肉眼观察细胞沉底情况),小心吸出2.5ml上清转移到离心管,离心1000rpm 3~5min,离心后的细沉淀用2.5ml新鲜培养重悬后放回原瓶继续培养。


半换液法

细胞生长时,聚集的细胞团会逐渐增大,正常的细胞团在显微镜下呈现白色透亮状。若细胞聚集太多,出现细胞团中部发暗时,可传代;

传代方法:

▶ 将细胞团用移液器轻轻吹散(一般吹2-3次即可,吹打力度不可过大,否则会出现大量死细胞和细胞碎片),均分到两个瓶子里,每瓶再补充等量培养基。

细胞对营养要求很高,千万不能团块太大,这会导致营养不足;细胞团块过大时,需要稍微吹散,注意控制吹打次数,不需要全部吹散。


03

细胞冻存

推荐使用90%FBS+10%DMSO的冻存液配比,NK92细胞系可适量补加IL-2,NK-92MI无需添加;

细胞冻存的时候,尽量吹散细胞,注意控制吹打力度。


04

细胞复苏

NK-92MI与NK-92细胞的复苏培养方法相同,操作步骤如下:

复苏后,用5ml新鲜培养基,重悬细胞;

瓶子竖着(瓶盖朝上)放进培养箱,以增加细胞局部密度,瓶盖保持透气;

细胞生长需要稳定的环境,可每天观察1次,不要频繁拿出培养箱观察;

每3天补液一次,补充1-2ml新鲜培养基即可,补加1-2次之后半量换液,不要频繁离心;

观察到培养基明显变黄,细胞团块明显变大后可以分瓶,一次传代最多分一瓶同等大小培养瓶。


05

 细胞团块是否需要吹散

减少离心次数,控制传代时的吹打次数。团块需要吹散,但不用刻意吹散成单颗;

正常传代或者离心换液后吹打,控制吹打次数以及力度,即使细胞都分散成单个,也会在1~2天内聚集起来;

细胞团太大时,需要分散;

细胞冻存的时候,细胞需要尽量分散,否则影响冻存效果。


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