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细胞学堂 | LNCaP clone FGC细胞培养攻略

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2022-01-26 09:39:38

人前列腺癌细胞LNCaP Clone FGC,是1977年从一位50岁白人男性(血型B+)的左锁骨淋巴结针刺活检中分离的,当时该患者已确诊为转移性前列腺癌。根据报道,该细胞对5-α-二氢睾酮(生长调节并生成酸性磷酸酶ACP)有响应。 



那如何养好LNCaP Clone FGC 呢?普诺赛今天来为你们详细讲解。


培养注意事项


01    

该细胞并不形成一致的单层,而是形成集落;

02

该细胞会使培养基快速变酸,且生长缓慢,故传代后 48 小时内不应扰动;

03

普通TC处理的培养瓶或皿不能使细胞很好的贴壁,培养难度较高,需使用 Corning 的 cellbind 细胞培养瓶(货号是 3289),或者使用多聚-L-赖氨酸溶液(货号 PB180523)包被过的培养皿;

04

在细胞运输途中,多数细胞会从培养瓶底分离,大片悬浮在培养基中,按照收货注意事项处理即可恢复正常。


正常生长的LNCaP Clone FGC细胞

▲ 正常生长的LNCaP Clone FGC细胞

聚集生长的LNCaP Clone FGC细胞

▲ 聚集生长的LNCaP Clone FGC细胞


收货处理方式


收货后,如果发现细胞漂浮或成团,可按下面的步骤进行处理:


01

将培养瓶内的所有培养基,转入无菌离心管,离心收集细胞(1200rpm 3min);

02

去掉上清,用PBS重悬细胞,将细胞收集到一个离心管中,PBS震动离心管混匀即可,再次离心(1200rpm 3min);

03

去掉上清,加入1ml左右0.25%胰酶,重悬混匀细胞。震动离心管,混匀即可,不能吹打。放入培养箱,消化细胞,消化时间3分钟左右;

04

消化完毕后,用移液枪轻轻吹打细胞悬液,使细胞团分散。加入5ml含血清的培养基,混匀后终止消化,离心(12    00rpm 3min);

05

去掉上清,加入5-7ml相应完全培养基混匀,轻轻/反复吹打细胞,接种于无菌T25瓶中(接种容器应提前用对应培养基浸润)。


LNCaP Clone FGC细胞到货漂浮

▲ LNCaP Clone FGC细胞到货漂浮

LNCaP Clone FGC细胞接种量少

▲ LNCaP Clone FGC细胞接种量少


传代步骤


01

吸出原培养液;

02

加入2ml左右PBS,轻轻晃动培养瓶,润洗细胞,吸出PBS,丢弃;

03

加入1ml左右胰酶,轻轻晃动培养瓶,使之浸润所有细胞;

04

放入培养箱消化,消化5分钟左右,显微镜下可看到,细胞块中间的细胞明显分离变圆,且自然脱落(全程不要拍打培养瓶);

05

加入3ml含血清的培养基,终止消化,轻轻/反复吹打细胞,在显微镜下观察。细胞悬液中,细胞尽量为单个状态;

06

收集细胞悬液,离心(1200rpm 3min)。离心完,吸出上清,丢弃;

07

加入新鲜培养基,吹打几下,混匀细胞即可。按需接种到新培养瓶,补充足量培养基,拧松瓶盖,或使用透气瓶盖进行培养;

08

检查培养箱的二氧化碳、温度及水盘。


传代比例和频次


推荐1:2~1:4传代,每4~5天传代一次。



换液步骤


吸出旧培养基,沿培养瓶侧边加入新培养基;

每3天换液一次。


冻存步骤


01

配置冻存液。推荐配比:55%(基础培养基1640)+40%(血清)+5%(DMSO);

02

DMSO配置时会放热,一定要等冻存液冷却后再使用,避免灼伤细胞;

03

细胞消化好后用新鲜培养基中止,制成细胞悬液;

04

1200rpm 3min 离心后去上清,尽量吸干净上清;

05

加入配置好的冻存液,重悬,建议一个T25长满冻存1支,或者细胞计数后,按照2-5×106cells/支的比例冻存;

06

将分装好的冻存液转入程序冻存盒,放入-80℃冰箱过夜;

07

从-80℃冰箱取出冻存管,迅速转移到液氮,长期保存。


复苏步骤


01

将水浴锅预热至37℃,准备好干净的一次性手套,向一个无菌离心管内,加入9ml无菌培养基;

02

将LNCaP Clone FGC细胞从液氮罐中取出,放入一次性手套中,迅速没入水浴锅。摇晃冻存管加速溶解,以1分钟内全部溶解为宜;

03

在超净台中,将复苏好的细胞液,加入到装有新鲜培养基的离心管内,1200rpm/min离心3分钟,离心完毕,去掉上清;

04

用适量与细胞对应的完全培养基重悬细胞,接入到无菌容器(培养瓶或培养皿)中,补充一定量培养基,放入培养箱培养;

05

溶解过程要迅速,已溶解的冻存细胞不能在常温下存放太久,需尽快离心去除DMSO。


参考文献: 

[1].https://www.cellbank.org.cn/cellbank_upload/20191204161104_6905.pdf


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