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细胞学堂 | HMC3人小胶质细胞培养从零开始

来源:Procell  浏览量:  发布时间:2022-03-29 13:28:33

基础信息


培养条件

培养液:MEM(含NEAA)10% FBS1% P/S

二氧化碳培养箱:稳定的温度(37℃),稳定的CO2水平(5%)

生长特性

贴壁,巨噬细胞样

传代比例和频次

推荐1:3~1:5传代,每3~4天传代一次

细胞类型

小胶质细胞

形态学

巨噬细胞


背景介绍


HMC3细胞系,是通过人胎脑源性原代小胶质细胞培养物的 SV40 依赖性永生化建立的,静息 HMC3 细胞的小胶质细胞/巨噬细胞标志物IBA1呈强阳性,星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性。

活化小胶质细胞的标志物,即MHCII、CD68 和 CD11b,在静息 HMC3 细胞中呈阴性,但在被 IFN-γ(10ng/mL,24 小时)激活后上调。


具体应用


神经科学,神经炎症

转化的人小胶质细胞代表可以无限生长的同质细胞群,并且可以用于小胶质细胞功能的生化分析的便捷系统。正如实验所证明的,它们还可以进行转染,这对研究小胶质细胞中各种转染基因的表达调控有重要意义。


培养注意事项


1

2-3天换液一次;

2

培养过程中可能会有细胞碎片产生,及时换液除去即可。


传代步骤


1

吸出原培养液;

2

加入2mL左右PBS,轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃;

3

加入1mL左右胰酶,轻轻晃动培养瓶,使之浸润所有细胞;

4

放入培养箱消化,消化2-3分钟,轻拍培养瓶侧壁,显微镜下看到细胞脱壁且聚集的细胞团松散开后,可终止;

5

加入3mL含血清的培养基,终止消化,吹打细胞使之脱壁,并在液体里反复吹打,使细胞混匀为悬浮液,这时可以在显微镜观察;

6

收集细胞悬液离心,1200rpm/min 3分钟,离心完吸出上清丢弃;

7

加入新鲜培养基,吹打几下混匀细胞即可;按需接种到新培养瓶,补足培养基,拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养;

8

检查培养箱二氧化碳、温度和水盘。


换液步骤


1

吸出旧培养基,用PBS进行润洗,然后加入新的培养基;

2

每2~3天换液一次


冻存步骤


1

配制冻存液,冻存液推荐配比:

55%(基础培养基DM/F12)+40%(血清)+5%(DMSO)

2

DMSO配制的时候会发热,一定要等冻存液冷却后使用,避免灼伤细胞;

3

细胞消化下来制成细胞悬液;

4

1200rpm 3分钟离心后去上清,尽量吸干净上清;

5

加入配制好的冻存液重悬,建议一个T25长满,冻存1支,或者细胞计数后,按照3~5×106cells/支冻

6

分装好的冻存液转入程序冻存盒,放入-80℃冰箱过夜;

7

从-80℃冰箱取出冻存管,并迅速转移到液氮长期保存。


复苏步骤


1

将水浴锅预热至37℃,准备好干净的一次性PE手套,向一个无菌离心管内加入5mL无菌培养基;

2

将细胞从液氮罐中取出,放入PE手套中,迅速没入水浴锅,摇晃冻存管,使细胞快速溶解,以1分钟内全部溶解为宜

3

在超净台中,将复苏好的细胞液加入到装有新鲜培养基的离心管内,1200rpm/min离心3分钟,离心完毕去掉上清;

4

取适量专用完全培养基重悬细胞,接入到无菌容器中(培养瓶或培养皿),补充培养基到适宜,放入培养箱培养;

5

溶解过程要快,已溶解的冻存细胞在常温中尽量短时间存放,尽快离心去除DMSO。


HMC3细胞正常生长
HMC3细胞正常生长

图1. HMC3细胞正常生长


参考文献


[1] Nakagawa Y, Chiba K. Diversity and plasticity of microglial cells in psychiatric and neurological disorders. Pharmacol Thera 154: 21–35, 2015. PubMed: 26129625

[2] Janabi N, et al. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neurosci Lett 195(2): 105-108, 1995. PubMed: 7478261

[3] Li B, et al. NOX4 expression in human microglia leads to constitutive generation of reactive oxygen species and to constitutive IL-6 expression. J Innate Immun 1(6): 570–581, 2009. PubMed: 20375612

[4] Jadhav VS, et al. HIV-1 Tat C modulates NOX2 and NOX4 expressions through miR-17 in a human microglial cell line. J Neurochem 131(6): 803-815, 2014. PubMed: 25146963

[5] Dello Russo C, et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. J Neuroinflammation 15(1):259, 2018. PubMed: 30200996


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