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细胞学堂 | 原代细胞和RAW 264.7诱导破骨细胞攻略!

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2022-07-12 14:12:16


骨骼系统为支撑身体、协调躯体运动、控制矿物质稳态和造血提供了重要的基础。破骨细胞是由单核/巨噬细胞造血谱系前体细胞融合而成的特化细胞,在骨稳态和健康维持中至关重要。已有大量实验证实其细胞形成和功能失调与骨质疏松症、骨折愈合、骨关节炎和原发性/转移性骨肿瘤等密切相关。一直以来,破骨细胞作为“噬骨者(bone eaters)”,被聚焦于探讨其在骨稳态和疾病中的角色。


破骨细胞为终末分化细胞,不能传代,光镜下可观察到破骨细胞胞体较大、多核、有伪足和突起等特征。


破骨细胞形态

图1. 破骨细胞形态


在实验研究中,常通过诱导剂的诱导作用使体外培养的干细胞或单核细胞向破骨细胞分化,从而获得破骨细胞。此方法获得的是破骨样细胞,破骨样细胞是指原代或经诱导而来具有破骨细胞特性的细胞,近年来广泛用于破骨细胞的研究。诱导法可获得的细胞纯度高、数量大,可满足各种生化和分生实验。常见的破骨诱导方法有2种:



原代细胞诱导


提取原代细胞,用巨噬细胞集落刺激因子( M-CSF),和核因子KB 受体活化因子配体( RANKL )诱导。

可使用25μg/L M-CSF+50μg/L RANKL的α-MEM培养基诱导,隔3天换液一次,培养至第5天开始出现体积较大的破骨细胞。





目前发现的可诱导分化为破骨细胞的细胞系常见的是小鼠RAW 264. 7细胞系,下面我们以这个细胞为例介绍一下它的诱导方法。




RAW 264.7诱导


诱导试剂:可以用LPS诱导,RANKL诱导,或者M-CSF+ RANKL诱导。

1. LPS诱导:10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、100ng/mL LPS均能诱导,但30、50、100ng/mL LPS诱导的多核细胞数量更多,且30ng/mL LPS诱导的多核细胞大小明显增加。

不同浓度LPS诱导破骨细胞

图2. 不同浓度LPS诱导破骨


2. RANKL诱导:用含100μg/L RANKL的α-MEM培养基诱导,隔天换液一次,诱导培养至第4~5天出现大量多核细胞。

3. M-CSF+ RANKL诱导: 使用100 ng /mL RANKL 与 100 ng /mL M-CSF的DMEM完全培养基,每两天更新培养液一次,第4天左右开始出现破骨细胞。




抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色

TRAP主要反映了破骨细胞的活性及骨吸收能力,是破骨细胞的良好标志物,也是最常用的鉴定方法。待诱导出破骨细胞,可根据以下步骤进行鉴定。

TRAP染色步骤: 2.5%戊二醛固定细胞10 min,蒸馏水充分冲洗,用TRAP染液处理50 min,蒸馏水充分冲洗后甘油封片。阳性染色细胞呈红色,定位于胞浆, 阴性染色细胞呈黄色。


破骨细胞经TRAP染色

图3. 破骨细胞经TRAP染色


注意事项


原代细胞诱导形成的成熟破骨细胞数量及纯度有限,但骨吸收活性强;RAW264.7细胞系诱导产生的破骨细胞数量多纯度高,但吸收活性弱;


如果培养时,镜下较多细胞出现伪足时,细胞整体状态可能不好,这时的细胞不适合用于诱导破骨;


RAW264.7细胞的传代次数对其能否诱导成破骨细胞至关重要,代数越低,细胞的分化能力越高;


原代细胞诱导培养形成的破骨细胞周期长,一般在9-10天时才达到最佳状态;RAW 264.7诱导培养的周期稍短,一般在第5~6天时出现大量破骨细胞;


除了TRAP染色鉴定破骨细胞,通过观察细胞核的数量以及降钙素受体染色和观察骨(牙)片吸收陷窝,可以进一步鉴定破骨细胞是否具有骨吸收能力。



参考文献

[1] 付应霄, 顾建红, 王世涛,等. 2种方法诱导形成的破骨细胞特性比较[J]. 中国兽医学报, 2013, 33(1):5.

[2] 王晓庚, 刘文佳, 周洪,等. 不同浓度破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子体外诱导大鼠破骨样细胞形成的研究[J]. 口腔医学, 2008, 28(4):4.

[3] 胡泽兵, 曹新生, 张舒. 破骨细胞体外培养技术[C]// 国际骨质疏松研讨会. 2014.

[4] Xiao Y ,  Cao Y ,  Song C , et al. Cellular study of the LPS‐induced osteoclastic multinucleated cell formation from RAW264.7 cells[J]. Journal of Cellular Physiology, 2020, 235(2457-2473).

[5] 杨也, 杨家福, 钟霞,等. 少阳生骨方含药血清对Raw264.7细胞向破骨细胞分化的影响及机制研究[J]. 世界最新医学信息文摘, 2020(36):4.

[6] 董世武, 胡文辉. 破而后立:骨骼系统中破骨细胞新功能解析[J]. 陆军军医大学学报, 2022, 44(1):10.


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