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Annexin V凋亡试剂盒常见问题及解决方案

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2023-03-13 17:08:05


QAnnexin V凋亡检测试剂盒的原理是什么?

AAnnexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合,将Annexin V标记荧光染料如FITC利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)7-AAD可与双链DNA特异性结合,并产生强烈的荧光,正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性,核染料PI7-AAD可进入细胞内对DNA进行染色,与Annexin V搭配使用,可区分处于不同凋亡时期的细胞。

 

QAnnexin V凋亡检测结果如何看?

image.png

A

1.Annexin V-PI-活细胞,Annexin VPI都无法染上;

2.Annexin V+PI-早期凋亡细胞,细胞PS外翻与Annexin V结合,细胞膜完整,PI无法染上;

3.Annexin V+PI+晚期凋亡或坏死细胞,细胞PS外翻与Annexin V结合,细胞膜受损,PI染料可以进入细胞内与DNA结合;

4.Annexin V-PI+裸核细胞,细胞膜结构丧失无法与Annexin V结合PI可以进入细胞与DNA结合;

 

Q:如何统计凋亡细胞数?

 A:Annexin V凋亡实验在做凋亡统计时一般统计总的凋亡比例(早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和),也有文献统计细胞早期凋亡率。

 

Q:血液样本是否可以用于凋亡检测?

A:不建议检测血液样本,血液中血小板及很多免疫细胞自身存在PS外翻的情况,会影响检测结果。

 

Q:检测凋亡用的细胞能否固定?

A甲醛固定液会造成结果假阳性,因此用于Annexin V凋亡检测的细胞不能进行固定。

需要注意的是,Annexin V检测的样本为外周血时,勿使用含有多聚甲醛等固定液成分的红细胞裂解液来处理细胞。

 

QAnnexin V系列有很多种不同组合试剂盒,该如何选择?

A挑选合适的Annexin V试剂盒,主要考虑两个方面:一是流式细胞仪的配置,二是细胞是否自带荧光(如转染了荧光的细胞、带荧光的药物来孵育细胞),在流式细胞仪配置允许的前提下,选择与细胞自发荧光使用不同检测通道的Annexin V试剂盒。

 

Q:说明书上写细胞量为1~5×105,细胞量多的话对检测结果有没有影响?

A建议细胞量最多不要超过106个,过量的细胞相当于染料被稀释,影响染色和分离效果。一般2×105个细胞足够进行凋亡检测了,通常情况下检测10,000个细胞就能得到比较好的结果。

 

Q:是否可以用PBS替代凋亡试剂盒里面的Binding Buffer

A可以Annexin VPS的结合依赖Ca2+Binding Buffer含有Ca2+,主要是促进Annexin VPS的结合。不加Binding Buffer,会导致Annexin V的结合能力降低,造成阳性信号大幅下降甚至无阳性信号。

 

Q:如何设置补偿管?

A实验设计时,考虑到补偿,建议设置全单染管调节补偿,如果样本有明显的自发荧光,且自发荧光对选择的染料有干扰,则必需设置一管只有自发荧光的细胞管(对于表达荧光蛋白的细胞,不加任何试剂的空白对照组作为EGFP的单阳组;对于有荧光的药物,细胞只加药物处理,作为药物的单阳组),用来调节补偿,以扣除自发荧光对其它通道的干扰。

 

Q:染色完不能及时上机,样本能否固定?

A细胞染色完成后,禁止固定,尽快检测,如无法立即检测,可将样本管放冰上,以减少外界环境对检测结果的影响,Annexin V结合不稳定,请务必在标记结束后半小时内检测。如果实验室距离上机的地方较远,建议将细胞和试剂盒带到上机的地方,染色后立即检测。

 

Q:凋亡检测中如何设置对照组?凋亡检测时细胞全部检测都是阳性是什么原因?

AAnnexin V凋亡检测中,阴阳性的界定不是依据空白组(细胞中不加PI也不加Annexin V),而且依据阴性对照组(细胞不经过药物处理,但是加入PIAnnexin V)。这是因为一般情况下,凋亡检测中,加入PIAnnexin V之后是不洗涤的,这意味着溶液有本底的荧光,阴性对照的信号比空白组高,如果以空白组来定阴阳性界限会出现大量假阳性细胞。

 

Q:细胞里有一个过表达载体,表达出绿色荧光蛋白EGFP,需要避开绿色通道,该如何选择凋亡试剂盒?

A如果检测的流式细胞仪有DAPI通道,可以选择P-CA-248 Annexin V-APC/DAPI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒三种荧光之间没有补偿。如果没有DAPI通道,可以选P-CA-208 Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒,但要注意合理设置单染管(包括只有自发荧光的细胞管,否则7-AAD通道信号会出现干扰),用来调节补偿。

 


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