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直播答疑 | 难养细胞培养常见问题及解决方法

来源:Pricella  浏览量:  发布时间:2022-08-02 10:18:38

培养出状态良好的细胞,是实验成功的第一步。在7月20日开播的“常见难养细胞培养问题及解决方法”课程中,有很多老师就细胞培养提出了疑问。我们筛选出部分代表性问题,并作了详细解答。


HCT 116细胞很难消化成单细胞悬液,请问怎么解决?

HCT 116细胞很好消化,一般消化1~2min就可以,但是由于细胞生长速度非常快,汇合度达到80%以上细胞就会开始拥挤,单个细胞形态变小,细胞之间的边界变得模糊,这种过度拥挤的状态会影响最后的消化分散效果。

要将细胞消化分散好,可以参考一下两点建议进行处理:

1. 培养过程中细胞密度不要过高,80%~90%即可传代,确保细胞不会过度密集;

2. 消化的时候胰酶量不要太多,一般T25瓶加1mL胰酶,轻轻晃动将瓶底覆盖后吸出多余的胰酶,保留0.5mL左右胰酶消化,消化过程中不要晃动培养瓶,避免细胞没分散好就从瓶底脱落。


从ATCC购得的HK-2细胞,传2~3代就是状态不好,细胞形态像碎了一样,用的是DMEM/F12培养基和10%血清。请问怎么办?

这是细胞培养条件适应的问题,ATCC的HK-2使用的是无血清培养基K-SFM,突然更换成DMEM/F12+10%FBS来培养,可能会出现细胞不适应以及状态变差的情况。正确的办法是先用原本的培养条件K-SFM扩增好之后,再尝试更换培养基。更换培养基时,建议先将两种培养基按比例混合使用后,再慢慢更换成想要的培养基。


SF9必须用密闭的培养瓶吗?

常规细胞培养时用到的DMEM、1640、F-12K等培养基缓冲体系为NaHCO3,需要用CO2进行平衡,而培养SF9用的昆虫培养基不含这种成分,在CO2存在的情况下会导致培养基变酸,影响细胞生长。所以SF9培养的环境是100%空气,27℃~28℃,饱和湿度,直接将培养箱CO2浓度调为0即可,并非必须用密闭的培养瓶


SP2/0养久了细胞状态变差了,怎么办?用什么样的血清比较好?

细胞培养时间久了,状态出现变化其实是比较常见的现象,细胞培养过程中需要控制的变量太多,任何环节出现问题都可能会导致细胞状态变差或者培养失败。一般建议在细胞传代3~5代,状态良好时进行适当冻存,后续培养出现异常情况也可以用冻存的细胞进行补救

选择血清的标准,就是能把手头在养的细胞养好就行,所以选择的方法就是在准备更换血清批次前先用试用装,确定该批次的血清培养自己的细胞是没有问题的,然后再进行购买。注意要在当前批次血清用完之前就准备下个批次血清的筛选,避免出现选取筛选效果不好又没有合适血清使用的情况。


A498细胞用MEM培养的情况下,细胞出现肿胀破膜怎么处理?

细胞出现裂解死亡可以从以下三个方面进行排查:

一是检查细胞是否存在污染,细菌、真菌和支原体污染都有可能会导致细胞死亡;

二是检查使用的培养基是否存在质量问题。如PH值、渗透压出现异常也会导致裂解死亡,但是一般实验室没有检测条件,可以尝试更换培养基厂家或批号进行培养,如果后续培养正常则可能是培养基原因导致的;

三是培养箱环境是否出现问题。如培养箱温度过高,水盘干了等情况也会导致细胞死亡,特别是培养箱水盘,如果干了会导致培养基蒸发加快,渗透压升高从而导致细胞裂解死亡。


一般细胞培养结束,使用结束后怎么处理或销毁?

实验室细胞培养用过的试剂和耗材等废弃物都属于危险废弃物,处理方法是统一收集后,用专用的灭菌锅消毒处理(如果没有专用的灭菌锅,就用84消毒液等进行消毒后统一存放),然后交由有资质进行危废处理的单位进行处理,避免对环境造成污染


我养的HK-2动不动就浮起来,漂浮后还可以离心收集培养吗?

要看是用的什么培养条件培养的。如果是适应了血清培养的HK-2贴壁正常,一般不容易漂;如果是K-SFM培养的HK-2,贴壁过程比较慢,也容易有漂浮的细胞。

K-SFM培养基因为没有血清中促进细胞贴壁的成分,所以培养的大多数细胞都会存在贴壁困难的情况,在培养前可以先用明胶或多聚赖氨酸等对培养瓶进行包被,增强细胞贴壁能力,另外在传代之后2~3天尽量不要去移动细胞。

漂浮的细胞一般情况下是可以收集后继续培养的,但是在培养基中悬浮时间太长可能会导致细胞活力慢慢下降。培养2~3天时,如果大部分细胞贴壁,只有少量悬浮可以不用处理;但是如果是大部分细胞悬浮,只有少量贴壁,可以在换液过程中把上清中的细胞离心后单独处理


如何能让HepG2细胞在培养皿中尽量长得满一些,减少空隙?

Hep G2细胞的生长特点就是呈岛状生长,并且岛状生长的细胞扩张能力有限,长到一定大小之后就会堆积生长。要想细胞分散均匀,一方面是需要保证细胞消化过程中分散良好,另外一方面接种的初始密度不宜过低,否则就会有大面积的空白区域

另外如果实验需要Hep G2为分散良好的单层细胞,可以用多聚赖氨酸包被培养瓶后培养,细胞将会呈单层分散的形式生长,但是形态跟不包被时差异比较大,会变成长梭形细胞。


消化完后是用完全培养基还是不完全培养基终止消化的呀?

一般细胞用胰酶消化完之后使用完全培养基中止,起作用的主要是其中的血清成分,可以抑制胰酶的活性,所以理论上讲也是可以直接用血清中止,只是比较浪费。另外如果培养的细胞是用的无血清培养基,那么在中止时就不能使用完培中止,而应该选用胰酶抑制剂。


悬浮细胞的增殖正常,但是细胞形态很不一致,有形成突触样的形状,不呈现椭圆形,这是什么原因呢?

这要看具体是什么细胞,如果细胞本身就存在少量不同形状的细胞,则是正常;如果原本形态正常,但是突然出现形状变化,可能是培养条件改变导致的,需要在更换培养条件时注意

细胞正常的形态图片可以从两个途径获取,一是在购买细胞的机构官网查询,或索要细胞正常状态图片进行参考;二是可以查询国内外权威的数据库,可以参考:https://web.expasy.org/cellosaurus

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