直播答疑 | 难养细胞培养常见问题及解决方法

HCT 116细胞很好消化，一般消化1~2min就可以，但是由于细胞生长速度非常快，汇合度达到80%以上细胞就会开始拥挤，单个细胞形态变小，细胞之间的边界变得模糊，这种过度拥挤的状态会影响最后的消化分散效果。

要将细胞消化分散好，可以参考一下两点建议进行处理：

1. 培养过程中细胞密度不要过高，80%~90%即可传代，确保细胞不会过度密集；

2. 消化的时候胰酶量不要太多，一般T25瓶加1mL胰酶，轻轻晃动将瓶底覆盖后吸出多余的胰酶，保留0.5mL左右胰酶消化，消化过程中不要晃动培养瓶，避免细胞没分散好就从瓶底脱落。

这是细胞培养条件适应的问题，ATCC的HK-2使用的是无血清培养基K-SFM，突然更换成DMEM/F12+10%FBS来培养，可能会出现细胞不适应以及状态变差的情况。正确的办法是先用原本的培养条件K-SFM扩增好之后，再尝试更换培养基。更换培养基时，建议先将两种培养基按比例混合使用后，再慢慢更换成想要的培养基。

常规细胞培养时用到的DMEM、1640、F-12K等培养基缓冲体系为NaHCO₃，需要用CO₂进行平衡，而培养SF9用的昆虫培养基不含这种成分，在CO₂存在的情况下会导致培养基变酸，影响细胞生长。所以SF9培养的环境是100%空气，27℃~28℃，饱和湿度，直接将培养箱CO₂浓度调为0即可，并非必须用密闭的培养瓶。

细胞培养时间久了，状态出现变化其实是比较常见的现象，细胞培养过程中需要控制的变量太多，任何环节出现问题都可能会导致细胞状态变差或者培养失败。一般建议在细胞传代3~5代，状态良好时进行适当冻存，后续培养出现异常情况也可以用冻存的细胞进行补救。

选择血清的标准，就是能把手头在养的细胞养好就行，所以选择的方法就是在准备更换血清批次前先用试用装，确定该批次的血清培养自己的细胞是没有问题的，然后再进行购买。注意要在当前批次血清用完之前就准备下个批次血清的筛选，避免出现选取筛选效果不好又没有合适血清使用的情况。

细胞出现裂解死亡可以从以下三个方面进行排查：

一是检查细胞是否存在污染，细菌、真菌和支原体污染都有可能会导致细胞死亡；

二是检查使用的培养基是否存在质量问题。如PH值、渗透压出现异常也会导致裂解死亡，但是一般实验室没有检测条件，可以尝试更换培养基厂家或批号进行培养，如果后续培养正常则可能是培养基原因导致的；

三是培养箱环境是否出现问题。如培养箱温度过高，水盘干了等情况也会导致细胞死亡，特别是培养箱水盘，如果干了会导致培养基蒸发加快，渗透压升高从而导致细胞裂解死亡。

实验室细胞培养用过的试剂和耗材等废弃物都属于危险废弃物，处理方法是统一收集后，用专用的灭菌锅消毒处理（如果没有专用的灭菌锅，就用84消毒液等进行消毒后统一存放），然后交由有资质进行危废处理的单位进行处理，避免对环境造成污染。

要看是用的什么培养条件培养的。如果是适应了血清培养的HK-2贴壁正常，一般不容易漂；如果是K-SFM培养的HK-2，贴壁过程比较慢，也容易有漂浮的细胞。

K-SFM培养基因为没有血清中促进细胞贴壁的成分，所以培养的大多数细胞都会存在贴壁困难的情况，在培养前可以先用明胶或多聚赖氨酸等对培养瓶进行包被，增强细胞贴壁能力，另外在传代之后2~3天尽量不要去移动细胞。

漂浮的细胞一般情况下是可以收集后继续培养的，但是在培养基中悬浮时间太长可能会导致细胞活力慢慢下降。培养2~3天时，如果大部分细胞贴壁，只有少量悬浮可以不用处理；但是如果是大部分细胞悬浮，只有少量贴壁，可以在换液过程中把上清中的细胞离心后单独处理。

Hep G2细胞的生长特点就是呈岛状生长，并且岛状生长的细胞扩张能力有限，长到一定大小之后就会堆积生长。要想细胞分散均匀，一方面是需要保证细胞消化过程中分散良好，另外一方面接种的初始密度不宜过低，否则就会有大面积的空白区域。

另外如果实验需要Hep G2为分散良好的单层细胞，可以用多聚赖氨酸包被培养瓶后培养，细胞将会呈单层分散的形式生长，但是形态跟不包被时差异比较大，会变成长梭形细胞。

一般细胞用胰酶消化完之后使用完全培养基中止，起作用的主要是其中的血清成分，可以抑制胰酶的活性，所以理论上讲也是可以直接用血清中止，只是比较浪费。另外如果培养的细胞是用的无血清培养基，那么在中止时就不能使用完培中止，而应该选用胰酶抑制剂。

这要看具体是什么细胞，如果细胞本身就存在少量不同形状的细胞，则是正常；如果原本形态正常，但是突然出现形状变化，可能是培养条件改变导致的，需要在更换培养条件时注意。

细胞正常的形态图片可以从两个途径获取，一是在购买细胞的机构官网查询，或索要细胞正常状态图片进行参考；二是可以查询国内外权威的数据库，可以参考：https://web.expasy.org/cellosaurus。